바이러스 진단검사 방법 Real time RT PCR을 알아보자! -2 (PCR 개념편)

 

 

Real time RT PCR은 3가지 개념인 real time과 RT 역전사 , PCR 기능이 다 여러가지 섞여서 반응이 나타나는데요 

 

PCR 준비물!

 

PCR을 위해서는 2개의 프라이머, 열에 저항성이 큰 DNA 중합 효소, 4종류의 디옥시리보뉴클레오타이드(dNTP)가 필요하다.

프라이머 : DNA 합성 과정에서 3´ 말단을 제공하여 출발점 역할을 하는 짧은 단일 DNA 가닥

DNA 중합 효소 : 주형 가닥의 DNA에 상보적인 디옥시리보뉴클레오타이드를 연결하여 DNA를 합성하는 효소

디옥시리보뉴클레오타이드(dNTP) : DNA를 구성하는 기본 단위체로, 4가지 염기를 모두 제공해야 하므로 dATP, dTTP, dGTP, dCTP 4종류를 모두 넣어 주어야 한다.

 

 

3가지 개념중 하나인 PCR (중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction)) 이란? 

DNA 가닥은 상보적으로 결합 되어 있고 위쪽가닥과 아래 쪽가닥을 쫙펴서 뜯어 내어야 합니다. 

이것을 DNA 변성(열) 이라하며 뜯어내어야 합니다. 

이중 나선 DNA를 90~96 ℃의 높은 온도로 가열하여 단일 가닥으로 분리합니다.  → 분리된 각각의 DNA 가닥은 새로운 DNA를 합성하는 주형 DNA가 된다.

 

 

5'와 3'는 DNA의 말단 번호를 말하는 겁니다. 숫자는 디옥시리보오스의 탄소번호를 의미하는데, 5'말단은 당이고, 3'말단은 염기가 위치해 있습니다. 

DNA 사슬도 쫙펴면 처음과 끝이 있기 때문에 처음과 끝의 이름을 이렇게 붙인것이라고 생각하면됩니다. 

 

 

프라이머 붙이기 - 식히는 과정

 

 

 

 

DNA중에서도 관심유전자가 있는데 특이적으로 달라붙을수 있게 17개 이상으로 염기를 구성해야 특이적으로 구성해 놓는데 4개정도만하면 내가 원하는 곳이 아니라 다른곳에 가서 붙기 때문에 17개 이상 염기를 구성하는것이 올리고뉴클레오티드 입니다.  당, 인산, 염기가 갖추어진 구조입니다. 

프라이머 상보적 결합

1번과 2번이 상보적 결합이고 1번과 4번이 상보적 결합을 하였으니 

2,3 번은 상보적 결합을 합니다. 이사실을 이용하여 

 

각자 결과가 끝나면 원하는 길이만 큼의 관심 유전자가 만들어지기 시작합니다 이 가로 친값의 

만큼 늘어나게 됩니다 이것을 연쇄반응이라고 합니다. 이반응에 사용되는것이 

DNA 중합효소가 사용되는데  이 DNA 중합효소는 연쇄 반응(PCR)은 고온에서 반응이 진행되기 때문에 일반적인 DNA 중합 효소를 이용할 수 없고 고온에서도 변성되지 않는 Taq DNA 중합 효소를 이용한다. 이 효소는 고온에 미생물 사는 극호열균에서 얻었으며 최적 온도는 72 ℃로, 95 ℃ 정도의 고온에서도 변성이 일어나지 않는다고 합니다.